猪圆环病毒病并发非典型性猪瘟病例的诊断
猪圆环病毒病（PCVD）是由猪圆环病毒２型（PCV-2）感染引起的，主要造成猪只免疫功能低下，生长速度下降，常见的临床类型有种猪繁殖障碍、哺乳仔猪腹泻、断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、生长肥育猪皮炎肾病综合征（PDNS）等。近年来，猪群圆环病毒感染愈演愈烈，且常与细菌或其他病毒混合感染，在重症临床病例中，圆环病毒往往是“罪魁祸首”或成为主要“帮凶”，在临床病例中尤其是疫情严重病例中，大多数都能检测到PCV-2。PCV-2已成为危害养猪生产、干扰猪群疫苗免疫效果、影响猪群健康的最重要致病因素之一。另外，由于受猪圆环病毒病、高致病性猪蓝耳病等免疫抑制病的影响，蓝耳病与猪瘟疫苗免疫间的干扰作用，加之猪瘟变异毒株的广泛流行，导致猪瘟病例时有发生，非典型性猪瘟或猪瘟病毒（CSFV）的亚临床感染成为当前猪瘟的主要表现形式。因此，对PCV-2和CSFV的检测、防控具有特别重要的意义。笔者就一例圆环病毒病并发非典型性猪瘟的临床病例的综合诊断及防控进行报道，以期为两病临床混合感染病例的正确诊断和防控提供借鉴。
1、病例背景
山东省新泰市某规模化自繁自养猪场存栏经产母猪70余头，育肥猪400多头，猪群整体生产状况良好，母猪群每年各免疫一次猪瘟疫苗、蓝耳病经典毒株疫苗、伪狂犬疫苗及圆环病毒２型疫苗，仔猪30日龄时免疫一次猪瘟疫苗，其他疫苗未进行免疫。2015年11月中旬，该猪场部分体重为30～35 kg的育肥猪时有发生被其他猪只攻击的现象，被攻击后异常尖叫；挑出被攻击猪只隔离饲养，不久猪只前肢无法站立，体温稍升高至39.5 ℃，但食欲尚可，其他未见异常，病猪5～10 d内死亡。发病者均为相同阶段的育肥猪，症状相似，抗生素治疗无效，发病猪只死亡率高。
2、综合诊断
▌2.1 临床检查
送检病猪临床表现为：眼睑肿胀，眼结膜充血潮红，流泪，有结膜炎症状；鼻腔充满黏液，耳尖边缘坏死；颈部皮下及四肢内侧有点状出血，发病后前肢无法站立；其他未见明显异常。
▌2.2 剖检病变
将送检病猪颈动脉放血致死，剖检发现：病猪腹股沟淋巴结及肠系膜淋巴结明显肿大，下颌淋巴结轻度肿大；肺脏暗红色稍显实变，小叶间隙增宽，表面散布灰白色小气肿灶；脑膜充血水肿；肾脏表面散布白色斑点状病灶；另外颈部有一个化脓灶；其他未见明显异常。
▌2.3 组织病理学的检查
对剖检病猪的脑、脾脏、肝脏、肾脏、淋巴结及扁桃体采样，用10%中性福尔马林溶液固定，常规方法制作石蜡切片，苏木精-伊红（H.E.）染色，镜检。可见病猪肺脏呈典型的间质性肺炎病变，肺泡壁淋巴细胞、巨噬细胞浸润增生，纤维细胞增生而显著增厚，肺泡腔狭窄或闭锁，支气管周围淋巴细胞灶状浸润、增生，支气管管腔皱缩（见图１A、B ）；淋巴结内淋巴细胞弥漫性增生，被膜增厚，间质增宽，部分区域实质充血、出血，并见淋巴细胞灶状坏死（见图１C）；脑膜血管充血，脑膜下水肿，脑组织充血，胶质细胞增生（见图１D、E）；肾脏间质有大量淋巴细胞和单核细胞浸润灶，结缔组织增生，呈间质性肾炎病变（见图１F）。
A.间质性肺炎；B.支气管周围淋巴组织增生；C.出血性坏死性淋巴结炎；D.脑膜血管充血、脑膜下水肿；E.脑组织充血、胶质细胞增生；F.间质性肾炎。
图1 病猪的组织病理学变化
▌2.4 病原学的检查
对剖检病猪的脑、脾脏、肝脏、肾脏、淋巴结及扁桃体采样，液氮保存，将冻存于液氮中的组织病料解冻后取适量组织加入灭菌PBS液并研磨成匀浆，9 000 r/min离心４min，取上清液，使用北京全式金生物技术有限公司生产的Easy Pure Viral DNA／RNA Kit（批号为J30723）提取病毒核酸。根据GenBank中公布的序列分别设计CSFV、PCV-2的特异性引物，用PCR／RT-PCR方法扩增，将扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶中电泳，紫外凝胶成像仪下根据条带位置判定病猪的病原感染情况。
▌2.5 PCV-2基因序列分析
设计能够扩增PCV-2基因全长的特异性引物，从PCV-2阳性的病料中进行ORF2基因全长的扩增。将扩增产物进行胶回收、连接pMD18-T载体、转化至DH5α感受态细胞及增菌培养，而后将鉴定为ORF２基因阳性的菌液送到上海生工生物工程技术服务有限公司测序，对测序得到的基因序列进行氨基酸序列分析及同源性分析。
▌2.6 ORF2基因核苷酸及氨基酸系统发育分析
将经0.22 μm滤膜过滤后的病料研磨液接种于PK-15细胞，盲传３代后收取细胞及上清液。按上述PCR检测方法，扩增得到一条与预期大小相符的目的片段，将片段胶回收、克隆及测序后得到了全长为705 bp的CAP蛋白。利用MEGA 6.0软件包对CAP蛋白的核苷酸序列、推导氨基酸序列及系统发育进化树进行分析。
将分离到的病毒命名为SDTA。该毒株的ORF2基因经扩增后测序大小为705 bp，相似性分析结果表明，该毒株与其他参考毒株的核苷酸相似度介于94.3%～98.9%之间，氨基酸相似度介于59.2%～97.8%之间。
分离株与２Ｃ亚型的参考毒株DK1980株相比具有最低的核苷酸相似性（94.3%），与2E亚型的参考毒株05-24387相比具有最低的氨基酸相似性（59.2%）。而与1C亚型的参考毒株GZ相比具有最高的核苷酸（98.9%）和氨基酸(97.8%）相似性。
分离株（SDTA）与1C亚群的基因及氨基酸相似性最高，提示该分离株为1C亚群。
▌2.7 血清学的检测结果
为进一步明确发病猪场猪只的免疫状态，从发病猪前腔静脉采集血样，分离血清，采用美国IDEXX和韩国金诺试剂盒以抽取的20份发病猪血清进行血清抗体检测，包括CSFV（批号为107HS597）、猪蓝耳病病毒（PRRSV，批号为107HS599）、猪伪狂犬病毒gE 野毒（PRV gE，批号为EL668）、PCV-2（批号为EL266）。
根据该猪场育肥猪的发病情况与免疫背景，并结合病猪血清抗体检测结果可知：该猪场育肥猪在30日龄时仅做过一次猪瘟疫苗免疫，CSFV抗体阳性，但阻断率过高，不符合一免猪瘟抗体的消长规律，应该与猪瘟野毒感染有关；该场商品猪未免疫PCV-2疫苗，但抗体阳性，显然猪只有圆环病野毒感染。
结合该猪场育肥猪发病的临床症状、剖检病变及上述相关实验室检测结果分析，确定本次疫情由猪圆环病毒病并发非典型性猪瘟所致。
3 防治措施
▌3.1 隔离消毒
确定育肥猪舍中发病猪只，隔离消毒，对病情严重且无治疗价值的猪只予以淘汰扑杀；对全场所有猪舍尤其是发病猪舍加强带猪消毒，严禁发病猪舍猪只和工作人员与其他猪舍接触、串访，人员进出时要严格消毒。
▌3.2 紧急免疫
对发病猪群紧急注射2倍量高效PCV-2疫苗；1周后对整个育肥猪群加免一次猪瘟疫苗。免疫过程中保证一猪一针，切勿一个针头打到底，避免交叉感染。
▌3.3 制订新的免疫及药物保健程序
鉴于该猪场猪瘟疫苗免疫效果欠佳，存在圆环病野毒感染，蓝耳病病毒、伪狂犬病野毒抗体阴性的实际情况，重新制订了免疫程序：经产母猪产前圆环病毒疫苗２次免疫，两次免疫间隔30 d；猪瘟疫苗每年3次普免。仔猪圆环病毒疫苗13日龄初免，3周后二免；猪瘟疫苗出生时超免，35日龄ST传代细胞苗二免，70日龄三免。
仔猪断奶前后及转入保育舍后，用氟苯尼考、替米考星、恩诺沙星等药物交替使用控制气喘病、副猪嗜血杆菌病、传染性胸膜肺炎、猪肺疫等呼吸道疾病，硫酸新霉素、黏杆菌素等控制细菌性肠炎，同时在饲料中添加黄芪多糖增强机体免疫力。
▌3.4 加强饲养管理
降低保育猪群饲养密度，改善通风环境，及时清理粪便，保持圈舍干燥，定期杀虫灭鼠，做好消毒工作。
通过实施以上综合防控措施，半年后回访该场得知，当时除个别病重猪只死亡外，大部分发病猪恢复了健康，并取得了较好的生产成绩。
作者 | 陈同煜 于 涛 刘思当 秦四海
山东农业大学 动物科技学院
新泰市新甫街道办事处
临沂大学 生命科学学院